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四、真核基因表达调控 （ 一）真核基因组结构特点 1。真核基因组结构庞大 哺乳类动物基因组DNA长达3×109个bp。 2。单顺反子 真核基因转录产物为单顺反子，即一个编码基因转录生成一个mRNA分子，经翻译生成一条 多肽链。 3。重复序列 在原核、真核DNA中都有重复出现的核苷酸序列，但在真核更普遍。根据重复频率可将重 复序列区分为高度重复序列（106次）、中度重复序列（103～104）及单拷贝序列。单拷贝序列在整个基因组中只出现一次或很少的几次。 4。基因不连续性 真核结构基因两侧存在不被转录的非编码序列，往往是基因表达的调控区。在编码基因内部 尚有一些不为蛋白质所编码的间隔序列，称内含子，而编码序列称为外显子，因此真核基因是不连续的。 （二）真核基因表达调控特点 1。RNA聚合酶 真核RNA聚合酶有三种，即RNA polⅠ、Ⅱ、Ⅲ，分别负责三种RNA转录。TATA盒结合蛋 白为三种聚合酶所共有。 2。活性染色体结构变化 （1）对核酸酶敏感。 （2）DNA拓扑结构变化。 天然状态的双链DNA以负性超螺旋的构象存在。当基因活化 时，RNA聚合酶前方的转录区DNA拓扑结构为正性超螺旋，后面的DNA则为负超螺旋，正性超螺旋不仅阻碍核小体结构形成，而且促进组蛋白 H 2A ·H2B二聚体的释放，有利转录。 （3）DNA碱基修饰变化。在真核DNA有约5％的胞嘧啶被甲基化为5甲基胞嘧啶，甲基化范围与基因表达程度是反比关系。处于转录活化状态的基因CpG序列一般是低甲基化的。 （4）组蛋白变化。 ①H1样组蛋白减少。②H 2A ·H2B二聚体不稳定性增加。③组蛋白修 饰：最常见的修饰有乙酰化、泛素化，修饰后使核小体结构变得不稳定。④H3组蛋白巯基 暴露。 3。正性调节占主导 提高了蛋白…DNA相互作用的指导性，经济有效。4。转录与翻译间隔进行 真核细胞有细胞核及胞浆等区间分布，转录与翻译在不同亚细胞结构中进行。 5。转录后修饰、加工
（三）真核基因转录激活调节 ☆ 1。顺式作用元件 顺式作用元件是特异转录因子的结合位点，按功能特性，真核基因顺式作用元件分为启动 子、增强子及沉默子。
（1）启动子。真核基因启动子是RNA聚合酶结合位点周围的一组转录控制组件，每一组件 含7－20bp的DNA序列。启动子包括至少一个转录起始点，以及一个以上的功能组件。在这些功能组件中最具典型意义的就是TATA盒，TATA盒通常位于转录起始点上游…25至 30bp，控制转录起始的准确性及频率。典型的启动子由TATA盒及上游的CCAAT盒和（ 或）GC盒组成，这类启动于通常具有一个转录起始点及较高的转录活性。然而，还有很多 启动子并不含TATA盒，这类启动子分为两类：一类为富含GC的启动子，最初发现于一类管 家基因，这类启动于包括一个或数个分离的转录起始点；另一类启动子既不含TATA盒，也 没有GC富含区，这类启动子可有一个或多个转录起始点，但多数转录活性很低或根本没有 转录活性，而是在胚胎发育、组织分化或再生过程中受调节。
（2）增强子 是远离转录起始点、决定基因的时间、空间特异性表达、增强启 动子转录活性的DNA序列，其发挥作用的方式通常与方向、距离无关，可位于转录起始点 的上游或下游。从功能上讲，没有增强子存在，启动子通常不能表现活性；没有启动子时， 增强子也无法发挥作用。
（3）沉默子某些基因含有负性调节元件沉默子，当其结合特异蛋白因子时，对基因 转录起阻遏作用。
☆2。转录调节因子 （1）转录调节因子分类。两类：①基本转录因子是RNA聚合酶结合启动子 所必需的一组因子，为所有mRNA转录起动共有②特异转录因子为个别基因转录所必需，决定该基因的时间、空间特异性表达，包括转录激活因子和抑制因子。（2）转录调节因子结构。所有转录因子至少包括两个结构域：DNA结合域和转录激活域； 此外，很多转录因子还包含一个介导蛋白质…蛋白质相互作用的结构域，最常见的是二聚化 结构域。①DNA结合域通常由60－100个氨基酸残基组成。最常见的DNA结合域结构形式 是锌指结构和碱性α螺旋。类似的碱性DNA结合域多见于碱性亮氨酸拉链和碱性螺旋…环…螺 旋。②转录激活域——由30…100个氨基酸残基组成。根据氨基酸组成特点，转录激活域又 有酸性激活域、谷氨酰胺富含区域及脯氨酸富含区域。③介导二聚化的结构域——二聚化作 用与亮氨酸拉链、螺旋…环…螺旋结构有关。 3。mRMA转录激活及其调节 真核RNA聚合酶Ⅱ不能单独识别、结合启动子，而是先由基本转录因子TFⅡD组成成分TBP 识别TATA盒或启动元件，并有TFⅡA参与结合，形成TFⅡD…启动子复合物；继而在TGⅡ AF等参与下，RNA聚合酶Ⅱ与TFⅡD、TFⅡB聚合，形成一个功能性的前起始复合物。在 几种基本转录因子中，TFⅡD是唯一具有位点特异的DNA结合能力的转录因子，在上述有 序的组装过程起关键性指导作用。这样形成的前起始复合物尚不稳定，也不能有效启动 mRMA转录。然后由结合在增强子上的转录激活因子直接或间接与TFⅡD结合，从而影响 前起始复合物的形成、稳定性以及RNA聚合酶的活性。
◆克隆与克隆化 所谓克隆就是指同一副本或拷贝的集合。获取同一拷贝的过程称为克隆化。为某一研究目的，从众多不同的分子群体中分离的某一感兴趣分子，继而经无性繁殖（扩增）产生的很多 相同分子的集合，即为分子克隆。
2。DNA克隆 是应用酶学的方法，在体外将各种来源的遗传物质与载体DNA结合成一具有自我复制能力的DNA分子—复制子，继而通过转化或转染宿主细胞、筛选出含有目的基因 转化子细胞，再进行扩增、提取获得大量同一DNA分子，即DNA克隆又称重组DNA。
3。工具酶（1）限制性内切酶（2）DNA连接酶：催化DNA中相邻的5′磷酸基与3′羟基间形成磷酸二酯键，使DNA切口封合，连接DNA片段 （3）DNA聚合酶Ⅰ：a。合成双链cDNA中第二条链。 b。缺口平移制做探针。 c。DNA序列分析。 d。填补3′末端。 （4）Taq酶催化PCR反应，聚合DNA （5）反转录酶a。合成cDNA。b。替代DNA聚合酶Ⅰ进行填补，标记或DNA序列分析 （6）多聚核苷酸激酶催化DNA 5′羟基末端磷酸化，或标记探针 （7）碱性磷酸酶切除DNA5′末端磷酸基 （8）末端转移酶在3′羟基末端进行同系多聚核苷酸加尾。（9）DNA酶：切割DNA （10）RNA酶：切割RNA。
★ 重组DNA的基本原理 ①目的基因的获取，②基因载体的选择与构建，③目的 基因与载体的拼接，④重组DNA分子导入受体细胞，⑤筛选并无性繁殖含重组分子的受体 细胞（转化子）。
（一）目的基因的获取1。化学合成法：如果已知某基因的核苷酸序列，或根据某种基因产物的氨基酸序列推导出该 多肽编码基因的核苷酸序列，再利用DNA合成仪通过化学合成原理合成目的基因。 2。基因组DNA：采用物理方法（剪切或超声波）或限制性内切酶将染色体DNA切割成许多片 段，继而将它们与适当克隆载体结合，将重组DNA转入受体菌中扩增，每个细菌内都携带 一种重组DNA分子的多个拷贝。全部细菌所携带的各种染色体DNA片段就涵盖了基因组全 部信息，即基因文库。建立基因文库后，结合适当筛选方法从众多的转化子菌株中选出含某 一基因的菌株，扩增分离得到目的基因。 3。 cDNA：以mRNA为模板，利用反转录酶合成与mRNA互补的DNA，再复制成双链 cDNA片段，与适当载体连接后转入受体菌，扩增为cDNA文库。用适当方法cDNA文库中就 可以筛选分离到目的基因。 4。聚合酶链反应：在有模板DNA、引物及dNTP存在时，向DNA合成体系中引入热稳定的 Taq DNA聚合酶。反应体系经变性、退火及扩增循环自动。反复进行感兴趣DNA片段的酶 促合成，使目的基因按指数增长。
（二）克隆载体的选择与改建 1。质粒：存在于细菌染色体外，小型闭合环状双链DNA分子，可独立自主进行复制，含筛 选标记，含多种限制性内切酶的单一切割位点，可插入目的基因。 2。噬菌体：egλ噬菌体、MB载体 3。柯斯质粒与酵母人工染色体载体：用于插入大DNA片段。 4。病毒载体。
（三）外源基因与载体的连接 即DNA的体外重组。这