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Blot，简称WB法）；5。放射免疫沉淀法（RIP）。其中前三项常用于筛选试验，后二者用于确证试验。HIV感染后数周或数日内常不能检出抗体，95％的受染者在5个月内可测出抗体。但也有感染后3…4年仍不能检出抗体者，此时有必要检测HIV病毒。
（四）PCR技术检测HIV病毒
1．标本的采集与模板核酸的制备。从怀疑为AIDS和ARC患者以及无症状的同性恋者采集血液标本，分成两份，其中一份送往检测实验室与Glyciegel混合进行常规检验或者在…20～…80℃保存。另一份可在冻存之前通过聚蔗糖（Ficoll）离心分离，收集沉积细胞。此法亦适用于疑为HIV感染的母亲及出生6个月以上的新生儿的血液标本。
可采用下述方法自血液标本中分离外周血单核细胞（PMC）：
① 取4ml血液用Hanks液1：1稀释。
② 向含有1份淋巴细胞分离液的试管内轻轻加入两分稀释的血液，勿搅乱分层。
③ 2500r/min离心20min。
④
吸出介于淋巴细胞分散液和血浆层间的PMC层，再用Hanks液洗两遍。
⑤ 加入RPMI…1640生长液（10％胎牛血清，10％白介素…2，2μg/ml
polyberen 及2。5μg/ml的植物血凝集素P）；使细胞浓度为2×106/ml。
⑥ 置5％CO2的孵箱内于37℃培养2～3d，作为HIV分离的靶细胞。
2．模板核酸的提取。制备PCR模板核酸有多种方法，但其基本原理大致相同，使用的试剂因采取的方法不同而异。这里分别介绍两种从外周血单核细胞中提取DNA和RNA的方法。
（1）从外周血单核细胞中提取DNA
方法A：
① 取1ml经37℃快速解冻的Glyciegel冻存细胞置一支小离心管内。
② 加入2ml含有10％胎牛血清的RPMI…1640溶液洗一次。
③ 2500r/min离心10min，弃上清。
④ 沉淀的细胞用PBS洗两次，最后将细胞悬浮在溶液A（100mmol/KCl，10mmol/LTris…HCl，pH8。3）中，使细胞浓度为6×106/ml。
⑤ 加入等体积的溶液B（10mmol/LTris…HCl，pH8。3，2。5mmol/L
MgCl2，10％Tween20，10％NP…40）。
⑥ 于37℃保湿后置冰箱保存。
该方法也适用于无Glyciegel保存的肝素标本及新鲜样品经聚蔗糖…400离心制备的淋巴细胞DNA的提取。
方法B：
① 取4ml经37℃快速解冻的Glyciegel标本。
② 2500r/min离心10min，收集沉淀的细胞，上清液可作血清学研究用。
③ 用10ml0。9％NaCl（含50％葡萄糖）将沉淀的细胞洗一次。
④ 再用10ml 0。9％NaCl（含50％葡萄糖）洗两次。
⑤ 通过聚蔗糖…400离心，分离单核细胞。
⑥ 将单核细胞悬浮于0。5ml裂解缓冲液（10mmol/L，Tris…HCl
pH8。3，10mmol/L EDTA，10mmol/L NaCl，0。5％SDS，100μg/ml蛋白酶K）中使细胞裂解。
⑦
用酚一氯仿抽提两次，将水相转移到一支新的离心管内。
⑧ 加入3倍体积的无水乙醇，于…20℃放置20min，13000r/min离心10min，弃上清，沉淀物经真空干燥后，用100μl蒸H2O溶解，于…20℃保存。
该方法也适用于标本经聚蔗糖…400离心制备的单核细胞DNA的提取。
（2）从外周血单核细胞中提取RNA及其反转录
方法A：
① 5ml血液标本，通过聚蔗糖…400离心制备外周血单核细胞。
② 将细胞悬浮于10mlRPMI…1640离心制备外周血单核细胞。
③ 2500r/min离心20min，收集沉积细胞。
④
把细胞悬浮于一定体积的预冷的裂解缓冲液（0。4mmol/L
NaCl，10mmol/L Tris…HCl，pH8。3，1。5mmol/L MgCl2；0。5％ NP…40）中；使细胞浓度为104/ml。
⑤ 13000r/min，于4℃离心10min，收集上清液。
⑥ 把含有RNA的上清液转移到一支新管内，立即置…80℃保存，备用。
在RNA反转录前，先将RNA样品用DNase处理，除去样品中残留的DNA。经反转录得到的cDNA即可进行PCR扩增。RNA反转录操作如（7）～（9）。
⑦ 取10μlRNA样品加2。7U DNase I。
⑧ 于37℃保温10min；93℃10min；立即放入冰浴中冷却。
⑨ 另将一份DNase I处理过的RNA样品，加入RNase
A（15μg/份），37℃保温10min，置…20℃保存。
方法B：
① 取5ml新鲜血浆置一支离心管内。
② 40000r/min，4℃离心10min，收集沉淀。
③ 将沉淀物溶于变性液（4。0mmol/L异硫氰酸胍；25mmol/L柠檬酸缓冲液pH7。0；0。5
sarcosyl；0。1mmol/L2…巯基乙醇）中充分混匀。
④ 加入30μl2mmol/L乙酸钠缓冲液pH4。2；400μl酚和80μl氯仿/异戊醇混合液（24：1）；萃取1min；冰上放置20min。
⑤ 13000r/min离心20min。
⑥
轻轻将水相转移到一支新管中。
⑦ 加入3倍体积的无水乙醇；…20℃放置1h左右。
⑧ 13000r/min；4℃离心15min；收集沉淀。
⑨ 沉淀物用75％乙醇洗涤两次；真空干燥。
⑩ 加入10μl 水溶解；立即置…80℃保存或者反转录。
⑾ 取10μl RNA样品。
⑿ 加入10μl 1×PCR缓冲液（50mmol/L NaCl，10mmol/L
Tris … HCl，pH 8。3；1。5mmol/L MgCl2 0。01％明胶）；各0。2mmol/L四种dNTP；10pmol/GN
GHD QLP GX PUH R XHH TR 39；20URNA酶抑制剂（RNsin）；10U的AMV逆转录酶。
⒀ 42℃保温30～60min；然后93℃5min。
⒁ 立即置冰浴中冷却，备用。
由上述方法制得的RNA反转录样品，通过10％聚丙烯酰胺凝胶电泳可鉴定其特异性。
三、PCR扩增步骤
（一）引物的设计与合成
HIV PCR引物设计应遵寻引物设计的一般原则。由于HIV基因易发生变异，因而引物应在保守区内设计，一般在pol、evn、gag、tat基因中的核酸序列内设计，HIV感染的细胞往往很少，要从106个正常细胞中检出1个HIV感染细胞，PCR扩增的引物首先要具有特异的结合HIV相应基因能力，同时一般要采用巢式…PCR方法，来提高检测的灵敏性。
检测HIV引物的第二步骤就是扩增HIV感染细胞中的原病毒DNA。感染细胞与未感细胞混合得到连续的10倍感染细胞的稀释液。通常由103/106个感染细胞稀释至1/106个感染细胞。同时用其它逆转录病毒感染细胞的DNA作对照，进行PCR扩增。然后通过Southern杂交及DNA序列分析，进一步确定扩增产物的特异性。
已经被确定的保守区是gag，tat，evn，pol基因中的某些核苷酸序列。在用于临床标本检测之前，要对引物的特异性进行鉴定。通常取100pg含有HIV基因组序列的质粒DNA稀释液和2μg载体鲱鱼精DNA。如引物是特异的，它们就会指导单一的双股DNA片段的合成。合成的DNA片段相对应于两引物5′末端之间距离。如果是另一种DNA模板，就不会合成任何DNA片段。如果合成的DNA片段不是所预期的或除了有所预期的片段还有其它的DNA片段，那么可以考虑对PCR的条件进行某些改进，看是否能改善其特异性，否则要另选引物。
表6…20 用于HIV PCR扩增的引物及探针
引物
及探针
序列（5′3′）
基
因
区
片段（bp）
SK38
ATAACCACCTATCCCAGTAGGATAAAT
gag
115（HIV1）
SK39
TTTGGTCCTTGTCTTATGTCCAGAATGC
SK19（P）
ATCCTGGGATTAAATAAAATAGTAAGAATGTATAGCCCTAC
SK145
AGTGGGGGGACATCAAGCAGCCCATGCAAAT
gag
141（HIV1）
SK101
GCTATGTCAGTTCCCCTTGGTTCTC
139（HIV2）
SK102（P）
GAGACCATCAATGAGGAAGCTGCAGAATGGGAT
SK145
AGTGGGGGGACATCAAGCAGCCCATGCAAAT
gag
142（HIV1）
SK150
TGCTATGTCACTTCCCCTTGGTTCTCTC
139（HIV2）
SK102（P）
GAGACCATCAATGAGGAAGCTGCAGAATGGGAT
O…1
GGGCAAATGGTACATCAGGCCATATCAC
gag
525（HIV1）
O…2
TTTTACCTCCTGTGAAGCTTGCTCGGTC
I…2
TTGGTCCTTGTCTTATGTCC
gag
422（HIV1）
I…1
TTAATACGACTCACTATAGGGTAGAAGAGAAGGCTTTCAGC
GK55
CCTGCTATGTCACTTCCCCT
gag
190（HIV1）
GK56
TTATCAGAAGGAGCCACCCC
P…1
TTCTGTCAATGGCCATTGTTTAACTTTTGGGCCAT
pol
355（HIV1）
P…2
TAAAGGAAGCAAGCTCTATTAGATACAGGAGCAGCTGA
SK29
ACTAGGGAACCCACTGCT
Itr
105（HIV1）
SK30
GGTCTGAGGGATCTCTA
SK31（P）
ACCAGAGTCACACAACAGACGGGCACACACTACT
P13
TGGCGCCCGAACAGGGAC
LTR
168
P14
TACCCACGCTCTCGCAG
SK89
AGGAGCTGGTGGGGAACG
LTR
165（HIV2）
SK90
GTGCTGGTGAGAGTCTAGCA
SK91（P）
TTGAGCCCTGGGAGGTTCTCTCCAGCACTAGCAGGTAG
SK68
AGCAGCAGGAAGCACTATGG
env
142（HIV1）
SK69
CCAGACTGTGAGTTGCAACAG
SK7