按键盘上方向键 ← 或 → 可快速上下翻页，按键盘上的 Enter 键可回到本书目录页，按键盘上方向键 ↑ 可回到本页顶部！
————未阅读完？加入书签已便下次继续阅读！
env
142（HIV1）
SK69
CCAGACTGTGAGTTGCAACAG
SK70（P）
ACGGTACAGGCCAGACAATTATTGTCTGGTATAGT
CO1
ACAATTATTGTCTGGTATAG
env
135（HIV1）
CO2
AGGTATCTTTCCACAGGCAG
CO3（P）
TGAGTTGCAACAGATGCTGTTGCGCCTCAATAGCCCTCAG
CO71
TGTGGAGGGAATTCTTCTACTGTAA
env
320（HIV1）
CO72
TATAGAATTCACTTCTCCAATTGTCCCTCAT
CO75（P）
GAAATATTACAGGGCTGCTATTAACAAGAGATGGTGGTAA
（二）PCR扩增步骤
1．扩增条件
当选择的引物影响其特异性和扩增效果时，首先应考虑扩增的条件是否适宜。这些条件包括退火温度，PCR循环数，反应物浓度等。扩增的条件通常是1～4mmol/LMgCl2，0。5～1。0mmol/L
dNTP；每100μl反应体积2～4U Taq DNA聚合酶；2μgBSA；10pg靶DNA；扩增25～30循环；退火温度为37℃；引物浓度6μg/ml。在37～55℃之间变更退火温度可以找到提高产量和特异性的最佳温度。尽管每个实验室使用的扩增条件略有差异；但它们的原理都是相似的。
2。扩增的步骤
（1）取10μl （1。2μg）HIV…DNA样品。
（2）用10μl 1×PCR缓冲液（100mmol/LTris…HCl
pH8。8；500mmol/L KCl，2mmol/L MgCl 2 ；16mmol/L DTT）。
（3）加入10μl ；各1mmol/LdNTP；6。6μg/ml引物。
（4）反应混合物于93℃变性处理7min。
（5）冷却至室温；加入4U TaqDNA聚合酶；反应最终体积为100μl。
（6）加入50μl矿物油；离心10s。
（7）置70℃保温5min。
（8）PCR扩增25个循环；95℃1 min；55℃1min；70℃
1min；最后于70℃延伸10min。
PCR检测出现假阴性的原因有：标本中的HIV…DNA量极少，未能有效地扩增或扩增产物达不到检测水平；DNA模板和PCR产物未能完全变性，使得引物不能或较少与DNA片段结合，从而降低了最终产物的产量。如果临床标本中的HIV基因发生变异，也会出现假阴性。PCR假阳性的原因主要有：标本的交叉污染；重复使用不干净的器具。此外还要合理设置对照，阴性对照用无HIV…DNA标本的反应混合液，阳性对照用已知的HIV…DNA。
四、扩增产物的检测和分析
扩增产物的检测和分析可采用凝胶电泳，限制性内切酶图谱，DNA序列分析及分子杂交等技术。
（一）凝胶电泳分析
根据所采用的引物对之间DNA片段的长度，预计PCR产物的分子大小。通过与凝胶电泳后的DNA片段相比较，可初步判断PCR产物的特异性，然后将产物用限制性内切酶水解，进一步确定扩增产物的特异性。
（二）分子杂交分析
分子杂交既是检测PCR产物特异性的一种较好的方法，也是检测扩增产物的非限制性内切酶位点上碱基突变的有效方法。分子杂交法是根据标记探针与两条引物链之间特异DNA片段的互补性进行的。结果阳性说明PCR产物是特异性的。可利用多种等位基因特异性寡核苷酸探针与PCR产物进行分子杂交，检测PCR产物的碱基突变。现将检测HIV…DNA的PCR扩增产物常用的几种分子杂交技术分别介绍如下：
PCR扩增技术和分子杂交的敏感性。
PCR技术检测HIV具有敏感性高，特异性强的优点。该方法可检测血液及组织标本中微量的HIV及前病毒序列。如对HIV…1感染H9细胞的扩增产物进行液相杂交和EB染色的电泳凝胶来检测PCR技术的灵敏性。可检测到0。05感染细胞的RNA量（相当于5个感染H9细胞的HIV…1…RNA/5×106个未感染细胞）。
四、PCR技术在HIV检测中的应用
PCR可用来追踪HIV的自然感染史。可在其它血清学和病毒学标志出现前检测病毒序列，这样可判定无症状而且血清阴性患者潜在的HIV的传播性；可用来监测长潜伏期（4～7年）病人，以及在抗病毒治疗期间病毒的水平；也可用于HIV…1血清阳性母亲的婴儿的HIV检测。在婴儿出生后最初的6～9个月期间，他们的血液中存在母体的抗体，因此用PCR可判定婴儿是否真正被HIV感染。
（一）血清抗体阳性病人HIV序列的检测
有人从AIDS或ARC病人的外周血单核细胞培养物，精液细胞和精液上清制备DNA。然后用PCR法和逆转录酶测定法分别检测HIV…1。PCR扩增产物与32P标记的探针退火之后用BstNI消化。再进行聚丙烯酰胺凝胶电泳和自显影。结果表明，在逆转录酶阴性的28个细胞系中有9个以及用逆转录酶法不能确定的9个细胞系中有2个为阳性。这说明过去许多细胞培养物认为是阴性者，实际上用更敏感的PCR测定时则为阳性。
从血清阳性的HIV感染者的外周血单核细胞中可检测出前病毒序列。通过共培养分离出病毒的血清阳性的同性恋男人血液制备的DNA，用PCR可100％检出病毒序列；用血清阴性共培养阴性同性恋者的标本，经PCR扩增检出病毒序列者为64％，血清阴性正常人标本PCR检测也为阴性，表明未出现假阳性结果。由于HIV…1基因组的广泛的异源性，为提高检测的阳性率可采用多种引物（如LTR，gag和env基因的引物）。利用PCR法从313份已证实为抗体阳性的标本中检测出310份HIV阳性（99％）。
（二）血清抗体阴性病人的HIV序列的检测
由于在感染HIV后到出现免疫反应之前有一段滞后期；这个血清学阴性的滞后期通常长达6周至6个月；而且无抗体产生期可能更长些。在此期间受感染者往往检测不到抗体；因此；血清阴性的人也可能已感染HIV。PCR法在高危人群中检测到HIV…1比由血清学转阳确诊的时间可以提高6个月。对少数初次共培养呈阴性的人；甚至可在血清转阳之前24～39个月就能确诊为HIV…1感染。对血清学试验结果不能确定者；也可通过PCR作进一步分析和确诊。
（三）新生儿HIV序列的检测
HIV感染的母亲其婴儿由于母体抗体的存在；用抗体检测法通常为阳性。但实际上只有20％～60％的婴儿受到HIV感染。因此；对这些婴儿进行HIV感染的早期诊断是十分重要的。现已证明30～50％的这些新生儿可在母亲的子宫里；在分娩和引产或通过产后哺乳时从其母体感染HIV。新生儿血清阳性者并不能说明是HIV感染。因为母体HIV抗体可持续大约15个月之久。在一般情况下；婴儿并不表现出HIV感染的任何症状。病毒细胞培养法对婴儿并不是一种可靠实用的方法；HIV特异IgM抗体的检测在母体抗体存在下也是不可能的；在过量血清抗体存在下检出血清中的HIV抗原也是十分困难的。另外；婴幼儿被HIV感染后病情发展较快。早期诊断；对及时采取治疗措施；延缓阻止病情发展极为重要。目前所使用的抗病毒药毒性大；因而不能用于HIV抗体阳性而未感染的婴幼儿。但当用PCR检测出HIV…DNA序列后；即可进行抗病毒治疗以及加强免疫机能和营养的治疗。在一项研究中；14名血清阳性母亲的新生儿用PCR检测其中6个为阳性；在出生后12～15个月内血清阴性的10个儿童中有5个为PCR阳性。从血清阳性母亲出生1个月的新生儿中；收集的外周血单核细胞经PCR检测；7个为阳性的婴儿；其中5个在检测后10个月得AIDS；而PCR阴性的9个婴儿；在16个月的追踪检查期间身体状况良好。这些研究表明；PCR技术对被HIV感染母亲的新生儿和血清阴性儿童进行早期的直接的HIV…1检测是十分重要的。
PCR技术检测HIV…DNA序列对AIDS和ARC的确诊起着重要作用。但也有人认为
对已知HIV抗体、抗原或培养阳性的病人不必再做PCR。最合适的PCR检测对象是那些疑有HIV感染但又缺乏确切的血清学依据的人群，如上述的HIV阳性母亲所生的婴儿，阳性患者的性伴侣，静脉吸毒者和可疑的血清反应者。PCR技术还可用来检测血液制品及疫苗中有无HIV。
二、 艾滋病诊断标准：
1．艾滋病病毒抗体阳性，又具有下述任何一项者，可为实验确诊艾滋病病人。
（1）近期内（3…6个月）体重减轻10％以上，且持续发热达38℃一个月以上；
（2）近期内（3…6个月）体重减轻10％以上，且持续腹泻（每日达3…5次）一个月以上。
（3）卡氏肺囊虫肺炎（PCR）
（4）卡波济肉瘤KS。
（5）明显的霉菌或其他条件致病感染。
2．若抗体阳性者体重减轻、发热、腹泻症状接近上述第1项时，可为实验确诊艾滋病病人。
（1）CD4/CD8（辅助/抑制）淋巴细胞计数比值