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两点测验方法简单，不过两点测验的缺点也不容忽视。用两点测验确定基因的位置须做3个不同的杂交、测交。另外由于杂交亲体的遗传背景、后代群体的大小、生长条件等的变异，测验的准确性较低。
A。Sturtevant在进行基因定位时，并不知道基因在染色体上是如何排列的。他通过果蝇中与性别决定有关的染色体上基因间的重组频率分析，发现了重组频率的可累加性，从遗传学上明确了基因在染色体上呈线性排列。这个发生对确定遗传的染色体理论起极其显著的作用。
将基因在染色体上的相对位置和距离描绘出来的图称为遗传图（genetic map）或连锁遗传图（linkage genetic map）。在连锁传图上代表一对等位基因的位置称为基因位点。例如，番茄的P和H基因位点用遗传图表示出来就是：
14。4
P H
也可表示为：
P 14。4 H
根据遗传图中位点间的遗传距离，可以估计后代基因型的频率。例如，如果将pH/pH和Ph/Ph杂交再用ph/ph测交，后代中将出现即7。2％的PH基因型和7。2％的ph基因型，即42。8％的pH基因型和42。8％s的Ph基因型。
遗传图距完全来自于遗传分析。位点间的遗传距和位点间的实际距离基本上呈正比，但不能等同于实际距离。相同遗传图距在不同生物中所代表的实际距离可以相差几十倍。用重组频率表示的遗传图距是一个相对值，改变测交群体的大小，可能得到不同的遗传图距估计值，但位点间的实际距离是不变的。
在遗传图中只能标明位点间的相对位置。我们不知道位点在染色体上的具体位置甚至不知道它们位于哪一条染色体。基因的染色体定位将在其他章节中介绍。
4。3。2 三点测验
三点测验（three…point test crosses）利用三因子杂合体的测交后代检测基因间的连锁关系和估计连锁基因间的遗传距离。三点测验可以发现基因间的双交换，这在二点测验中是不可能的，因而计算出的遗传距离更加准确；另外，利用双交换所含的遗传信息，可直接确定基因的顺序。
4。3。2。1 三点杂交
对三因子杂合体测交可以同时确定3对基因在染色体上的位置。表4…2是玉米基因v，b，l的三因子杂合体测交资料。
表4…2 玉米基因v，b，l的三因子杂合体测交后代的类型和数目
类型 表型 数目 类型 表型 数目
①
②
③
④
⑤ Vbl
＋＋＋
＋b＋
v＋l
＋bl 302
298
115
105
80 ⑥
⑦
⑧ v＋＋
＋＋l
Vb＋ 72
20
19
总数 1011
在表4…2中频率相近的基因型被排列在一起，以便分析。基因型中基因间排列顺序是人为的。三因子杂合体可以产生8种不同的配子，在测交中上述基因型代表了所有8种配子类型。
对上面的资料进行系统地分析，发现数目最多的是①、②，比数目最少的⑦、⑧多得多（15倍以上）。每对基因间的4种基因型严重偏离1∶1∶1∶1的比例。例如，v和b之间的4种基因型及数目为vb（①＋⑧）321，＋＋（②＋⑦）318，＋b（③＋⑤）195，v＋（④＋⑥）177；b和l之间的4种基因型及数目为bl（①＋⑤）382，＋＋（②＋⑥）370，b＋（③＋⑧）134，＋l（④＋⑦）125。表明这3个基因相互连锁。
基因v和b之间的重组类型是③、④、⑤、⑥，其频率
基因b和l之间的重组类型是③、④、⑦、⑧，其频率
基因v和l之间的重组类型是⑤、⑥、⑦、⑧，其频率
3个重组频率都低于50％。v和b的重组频率最高，应当相距最远，l位点在v和b之间，用遗传图表示：
v l b
18。9 25。6
通过一次三因子杂交、测交分析，不仅确定了3个基因间的遗传距离，还弄清楚了它们在染色体上的排列顺序。
4。3。2。2 双交换与染色体作图
在v、l、b的连锁图中，v与l之间的距离加上l与b之间的距离等于44。1cm，比直接计算出的v与b之间的距离36。4cm大7。7cm，这是什么原因？如果把测交资料中数目相近的基因型归类在一起，可以分成4组：①与②，③与④，⑤与⑥和⑦与⑧。其中，⑦和⑧是频率最少的一组。根据这3个基因的连锁图，频率最高的①与②为亲本型，因此三因子杂合体的基因型为＋＋＋/vlb。产生⑦和⑧的配子基因型分别是＋l＋和v＋b。与三因子杂合体的基因型比较发现，这两类配子v与l之间，l与b之间各发生一次交换的结果（图4…7）。在一段染色体区域同时发生两次交换的现象称为双交换（double crossover）。由双交换形成的重组型配子称为双交换型配子。如果只发生一次交换，则称为单交换（single crossover）。双交换类型在三因子测交后代中数目最少，是其显著特征。
图4…7 双交换型配子的产生过程
前面在计算v与b之间的重组频率时，没有把双交换类型作为重组型加以考虑。对v与b来说，双交换基因型与亲本基因型没有区别，这就导致了v与b之间遗传距离的偏低估计。为了对此进行校正，在计算遗传距离时双交换类型必须计入两次，因为双交换类型是两次单交换的结果。因此，v与b的，v与b的图距为44。1，和v与l、l与b的距离之和相同。
从这个例子可以看出三点测验比两点测验准确。如果没有L这个位点，就没有办法检测出v与b之间的双交换。双交换与未发生交换的结果一样，尽管交换频率高，资料反映出的重组率却偏低。一般认为当两个基因相距小于5cm时，不易发生双交换。另一方面，如果两个基因间的距离很大，双交换甚至双交换以上的多重交换都有可能。发生双交换的频率常常与基因所在的染色体、在染色体上的位置、生物种类有关。在连锁遗传分析中，应尽可能地利用紧密连锁的标记基因以避免多重交换可能造成的影响，获得较准确的遗传图。
在三点测交中根据亲本配子基因型和双交换配子基因型可以直接推导出基因在染色体上的相对位置，而不必先进行重组频率计算。双交换类型是最少的一类，很容易辨别，最多的一类总是亲本型，剩下的4种重组类型都是单交换的结果。以上面3个基因为例，v，l，b的排列有3种可能：v…l…b，或v…b…l，或b…v…l。其中只有＋＋＋/vlb才能产生＋l＋和v＋b这两种双交换类型，因此v…l…b是正确的基因顺序。在发生双交换事件后，中间位点的一个等位基因一定和来自另一亲本的同源染色体上该位点两边的基因在一起；也就是说，只有能产生实际双交换配子的那种排列顺序才是正确的基因顺序。如果b在中间，vl＋、＋b＋就应该是双交换类型，这与观察到的双交换型不符。
确定了基因顺序后，就可以计算基因之间的交换值或遗传距离。
首先计算双交换值，在v和b之间的双交换值=。
然后计算涉及中间一个位点的两个单交换值。因为每个双交换中都包括了两次交换，在计算单交换值时要把双交换类型考虑进去。v与l的单交换值=，L与b的单交换值=。与前面的结果完全相同。
4。3。3 干扰和符合
双交换重组型的发现说明在一定的染色体区域可以在不同的部位同时发生一次以上的交换。那么这些交换事件是彼此独立的还是相互影响的呢？如果各个交换事件是独立的，根据概率论，双交换频率就应等于两个单交换频率的乘积。
在玉米的v…l…b资料中，v…l的交换值是18。8％，L…b的交换值是25。4％，两者的乘积为4。7％。这是当交换相互独立时理论上期望得到的双交换值。因此，在1011个后代中，应该有48个双交换类型。然而实际上只获得了39个双交换型。可见v…L间的交换和L…b间的交换不是独立的，v与L之间的交换使L与b之间的交换频率减少，或者L与b的交换使v与L之间的交换频率减少。这说明一个区域的交换可能影响相邻区域再发生交换。遗传学上，把观察到的双交换值与理论上期望得到的双交换值不相符的现象称为干扰（interference），把实际获得的双交换类型的数目或频率与理论上期望得到的双交换类型的数目或频率的比值称为符合系数（coefficient of coincidence； C）。
C=实际双交换值/理论双交换值
干扰值（I）=1…C
在v…l…b之间，I=。
当I=0时，没有干扰，理论值与实际观察值一致，C等于1。当I=1时，则没有双交换发生。大多数情况下0